乙型肝炎病毒前-前-S蛋白结合蛋白新基因PPSBP9的克隆化

作者:admin 来源:未知 点击数: 发布时间:2019年08月11日

  在线.i11.2733乙型肝炎病毒前-前-S卵白连系卵白新基因PPSBP9的克隆化蔺淑梅, 成军, 张树林, 刘敏, 王琳, 黄燕萍, 杨瑗, 白桂琴蔺淑梅, 张树林,西安交通大学第一病院传染科 陕西省西安市 710061成军, 刘敏, 王琳, 黄燕萍, 杨瑗,白桂芹, 中国人民解放军第302病院流行症研究所基因医治研究核心, 三军病毒性肝炎防治研究重点尝试室 北京市 100039ORCID number:$[AuthorORCIDs]国度天然科学基金攻关项目, No.C03011402, No. C30070689戎行九、五科技攻关项目, No.98D063戎行回国留学人员启动基金项目, No.98H038戎行十、五科技攻关青年基金项目, No.01Q138戎行十、五科技攻关面上项目, No.01MB135: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302病院流行症研究所基因医治研究核心, 三军病毒性肝炎防治研究重点尝试室.: 传真: 收稿日期:2004-05-28

  目标: 研究乙型肝炎病毒前-前-S卵白连系卵白新基因PPSBP9的克隆化.

  方式: 建立前-前-S的酵母细胞表达载体, 采用酵母双杂交系统筛选人肝细胞cDNA文库, 操纵核苷酸数据库及生物消息学手艺, 对于筛选成果进行阐发. 发觉此中有1个未知功能的新基因. 按照GenBank中的序列消息设想引物, 以HepG2细胞系cDNA文库为模板, 以逆转录多聚酶链反映(RT-PCR)手艺扩增获得该新基因的全长编码序列, 并经测序证明, 定名该新基由于PPSBP9并在GenBank中注册, 注册号为AY553877.

  成果:PPSBP9基因的编码序列全长为840个核苷酸(nt), 编码产品由279个氨基酸残基(aa)构成. 经核苷酸序列数据库(GenBank)和卵白质一级布局序列数据库(SwissProt)同源序列的搜索, 与已知基因序列和卵白序列之间没有显著同源性.

  结论: 筛选并成功的克隆了乙型肝炎病毒前-前-S卵白与肝细胞cDNA文库中连系卵白新基因PPSBP9, 为进一步研究HBV前-前-S及其肝细胞连系卵白新基因在HBV致病中的感化奠基了根本.

  Key Words:

  Citation:

  N/A.N/A.

  Shijie Huaren Xiaohua Zazhi

  2004;12(11): 2733-2736

  乙型肝炎病毒(HBV)传染常见, 不只惹起急、慢性病毒性肝炎, 并且与肝纤维化(LF)、肝细胞癌(HCC)的发生成长亲近相关[16]. HBV是很小的包膜病毒, HBV基因组全长在3 200个核苷酸(nt)摆布, 为部门双链DNA病毒. HBV至多含有4个开放读码框架(ORF), 别离定名为S、C、P、X区, 4个ORF中表达的氨基酸长度分歧, 其生物学功能也不不异, 此中全S区又因分歧的起始暗码子(ATG)而又报酬的分为前-S1、前-S2和S三个区, 前-S1、前-S2和概况抗原主卵白是按照统一开放读码挨次(in frame)进行翻译的. 比来董菁et al对于中国HBV风行株的全基因序列进行克隆和序列阐发, 发此刻前-S1区之前还具有一个ORF, 长度135 bp, 编码45 aa, 将其定名为前-前-S区. 并在既往已克隆的HBV基因组中获得了证明[7]. 杨倩et al对前-前-S基因启动子序列的判定和转录活性的研究证明, 前-前-S-基因ORF上游的序列具有启动子活性, 进一步证明了董菁et al发觉的前-前-S编码基因具有[8]. 基因是通过卵白质之间的彼此感化而实现其功能的, 病毒卵白和肝细胞卵白之间的感化是病毒致病的环节. 为进一步研究前-前-S-基因在HBV致病中的感化, 我们操纵酵母双杂交手艺对肝细胞cDNA文库中与乙型肝炎病毒前-前-S彼此感化的卵白进行研究, 获得了一种能与HBV前-前-S卵白连系的未知功能卵白, 将编码该卵白的基因定名为PPSBP9, 对其进行克隆化研究, 为此后进一步深切地研究新基因的生物学功能判定根本.

  PPSBP9的扩增引物合成及DNA序列测定由上海生工生物工程手艺办事无限公司承担.

  挑取真正的阳性集落按照试剂盒供给的操作指南Lyticase法提取酵母质粒. 提取的质粒以复杂冰冻高效感触感染态方式转化大肠杆菌, 于含有氨苄青霉素的SOB平板培育, 所获得的菌落酶切判定后测序. 阳性克隆DNA测序后, 提交GenBank比对, 进行生物消息学阐发.

  1.4 多聚酶链反映(PCR)扩增PPSBP9新基因

  将PCR产品在12 g/L琼脂糖凝胶中电泳, 切取目标片段, 玻璃奶法收受接管PCR产品, 与pGEM-T载体毗连, 转化DH5α感触感染态细菌, 在含氨苄青霉素的LB/X-gal/IPTG培育板上, 37 ℃培育15 h. 挑取阳性菌落, 增菌. 提取质粒进行限制性酶切阐发判定, 选择经判定的菌落送测序.

  对所筛选到的未知功能卵白基因此中之一操纵美国国立卫生院(NIH)国立医学藏书楼(NLM)国立生物工程核心(NCBI)成立的核苷酸序列数据库(GenBank)及其同源基因序列的搜刮(BLASTN), 发觉该克隆序列与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源. 电子拼接推定该基因的开放读码框架, 设想引物, 从HepG2细胞提取总RNA后, 进行RT-PCR, PCR产品经琼脂糖凝胶电泳后, 可见1条清晰、单一、大小约840 bp的特同性扩增条带(图1), 其大小与估计的相吻合. PCR产品与T-载体毗连, 转化大肠杆菌, 提取质粒进行酶切判定后送测序. 测序成果完全合适拼接序列, 表白我们已成功克隆出新基因的完整序列, 定名为PPSBP9, 其编码序列全长为840个核苷酸, 编码产品由279个氨基酸残基构成(图2). GenBank注册号为AY553877.

  PPSBP9

  基因的RT-PCR产品凝胶电泳图.

  1: DNA marker; 2: PCR product.

  PPSBP9

  基因的核苷酸序列及编码产品一级布局序列.

  酵母双杂交系统是近年来新成长起来的一种阐发真核细胞中卵白-卵白彼此感化的一种无效的基因阐发方式, 他的发生为研究卵白在体心里理环境下彼此感化供给了一种新的遗传学方式. 我们操纵此手艺, 已成功筛选到一系列与乙肝病毒卵白及丙肝病毒卵白相连系的卵白基因, 此中, 也包罗了一些未知功能卵白的基因[911].

  1979年Galibert et al[1213]初次演讲了HBV基因组的全序列, 并确定4个次要的开放读码框架(ORF), 别离定名为S、C、P、X区, 不断沿用至今. HBV基因组只要3.2 kb, 其布局特点是布局基因与功能基因序列之间堆叠, 以至布局基因序列之间堆叠[14]. 关于这一慎密DNA布局中能否具有新的编码序列, 不断没有进行系统的研究. 比来董菁et al[781519]对于中国HBV风行株的全基因序列进行克隆和序列阐发, 发觉了前-前-S和前-X基因序列, 改写了HBV DNA编码基因序列研究的汗青.

  HBV概况抗原即外膜卵白不只是病毒遗传布局的包装卵白, 病毒传染所必需, 也是惹起宿主庇护性应对的免疫原表位, 并且截短型概况抗原中卵白和大卵白具有反式激活感化[7], 这种功能是与概况抗原的多种形式激活癌基因相关[20]. 董菁et al进一步使用DNA SIS软件的卵白质阐发功能阐发了前-前-S、前-S1、前-S2和S基因的完全表达产品, 前-前-S区较以往认为的大卵白多出一个小的疏水区, 那么全S卵白(含前-前-S区)与大卵白有不小的差别. 此中的19(21)个疏水氨基酸在前-前-S区构成了一个小的疏水功能域, 可能与卵白的空间折叠或概况卵白合成后排泄相关. 进一步研究前-前-S所编码卵白的功能及与之彼此感化的卵白具有主要意义.

  我们使用酵母双杂交手艺成功的筛选出肝细胞文库中与前-前-S卵白彼此感化的卵白基因54种, 此中包罗HBV前-前-S卵白连系卵白9这一未知功能的新基因. 按照GenBank的消息, 电子拼接推定该基因的开放读码框架获得响应的全长编码基因, 我们设想了新基因的上下流引物, 并成功地从HepG2细胞的mRNA中逆转录出该基因的完整序列. PCR反映产品经T-A克隆测序完全合适计较机阐发成果, 表白我们已成功获得了该新基因的编码序列, 其编码序列全长为840个核苷酸, 编码279个氨基酸残基. 值得我们关心的是, 在对这一未知功能新基因进行进一步生物消息学阐发时发觉, 我们这一研究小组在用酵母双杂交手艺筛选HCV F卵白与肝细胞文库彼此感化的卵白时也筛选到这一不异的未知功能的新基因, 故我们将其定名为PPSBP9/HCVFbp2. 表白这一未知功能基因能与多种病毒卵白连系, 提醒这一未知功能基因可能在HBV, HCV传染的致病过程中阐扬主要感化. 新基因的发觉及克隆化成功为此后进一步深切地研究新基因的生物学功能奠基了根本.

(编辑:admin)
http://belowh2oscuba.com/bjgdb/167/