影响丁香假单胞菌冰核蛋白InaQ分泌活性效应基因的研究

作者:admin 来源:未知 点击数: 发布时间:2019年09月06日

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  影响丁香假单胞菌冰核卵白InaQ排泄活性效应基因的研究

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  影响丁香假单胞菌冰核卵白InaQ排泄活性效应基因的研究

  影响丁香假单胞菌冰核卵白InaQ排泄活性效应基因的研究

  作者:师大云端藏书楼

  时间:2016-08-28

  分类:硕士论文

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  【摘要】丁香假单胞菌是一种常见动物致病菌,能够激发多种动物发生超敏反映,并且该菌仍是一种冰核细菌,可使动物在较高温度下发生冻害。诱策动物冻害的环节要素为其排泄的一种卵白,冰核卵白(Icenucleationprotein,INP)。本课题以一株具有高冰核活性的丁香假单胞菌MB03为研究对象,建立了一个转座突变文库,对影响丁香假单胞菌冰核卵白排泄的相关活性效应基因的进行了研究。丁香假单胞菌MB03是本尝试室所分手保留的一株具有高冰核活性的丁香假单胞菌,其INP基因inaQ已完成克隆测序。本尝试操纵“他杀性”转座子pUT-miniTn5-Km2,采用双亲本接合的方式建立了丁香假单胞菌MB03的突变文库。按照inaQ基因序列设想引物扩增获得其N端,毗连pET-28a表达载体,获得INPN卵白并制备其抗血清,然后操纵免疫学方式对INP排泄进行阐发。先用膜杂交的方式对突变文库中菌株进行初步筛选,从中筛选出INP排泄发生较着变化的菌株,再对这些菌株进行Cy5流式细胞仪检考试证,从而获得INP排泄较着加强和较着削弱的菌株。对突变菌株的转座子插入位点判定采用改良的TAIL-PCR方式,通过已知序列上3个嵌套的特同性引物别离和简并引物组合进行持续的PCR轮回,选择性地扩增获得方针片段,扩减产物间接测序。通过TAIL-PCR,从几株InaQ排泄活性加强或削弱突变株中扩增到疑似插入位点侧翼基因。经对其测序和将测序成果与MB03基因组序列进行对比,最终判定出mini-Tn5插入失活的基因柠檬酸合成酶基因(gltA)、一种糖基转移酶基因和一种2-氧代酸脱氢酶基因等。本研究拔取此中的柠檬酸合成酶基因(gltA)进行了表达弥补,通过Realtime-qPCR和Westernblot阐发比力,测定了表达弥补菌株与野生菌株的冰核卵白InaQ表达活性与表达量,初步证明gltA基因的中缀可导致InaQ表达的降低。

  【作者】王经;

  【导师】李林;

  【作者根基消息】华中农业大学,微生物学,2014,硕士

  【环节词】丁香假单胞菌;冰核卵白;转座子;TAIL-PCR;柠檬酸合成酶基因;

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